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仪表网 研发快讯】在生物学研究的前沿，对活体组织中复杂三维亚细胞动态的非侵入性解析需求日益增长。为了实现空间分辨率、成像深度、光毒性三者的同时优化，北京大学席鹏教授团队将共聚焦扫描成像与结构光超分辨巧妙结合起来，提出一种多点晶格共聚焦图像扫描显微解决方案，通过优化针孔直径和间距、消除离焦信号和引入减帧重建算法来克服现有技术在时空分辨率平衡方面的局限性，极大地扩展了超分辨率成像在生物体内的应用范围。
随着生物医学的快速发展，在组织层面揭示其内部三维精细结构、捕捉快速生物动态过程等成像需求日益增加。共聚焦激光扫描显微技术因其卓越的光学切片能力和多功能性，在散射组织的深度成像中一直被视为首选。然而，缩小针孔尺寸以提升分辨率会导致信号下降，限制成像质量。图像扫描显微技术(Image Scanning Microscopy，ISM)通过将单点探测器替换为探测器阵列，基于像素重定位和解卷积算法，在保持共聚焦层切能力的同时实现了相比于衍射极限两倍的分辨率提升。相比于其他超分辨显微技术，ISM更能抵抗深度成像时所引起的像差和散射等问题。
席鹏团队提出多点共聚焦多点共聚焦图像扫描显微(Multi-confocal Image Scanning Microscopy，MC-ISM)技术，通过晶格针孔阵列产生多焦点照明，相比于传统ISM利用单点进行扫描，这种并行化的配置配合类似阿基米德螺线的单振镜扫描，极大提高了全视场成像速度。通过优化针孔直径和间距、应用光学锁相探测(OLID)处理抑制离焦信号，提高成像质量。基于像素重定位和进一步的解卷积后处理，MC-ISM可实现2倍的三维分辨率提升。此外，通过引入多图反卷积重建算法进行减帧重建，MC-ISM可进一步提高成像速度，比多焦点结构光照明
显微镜提高了16倍。
图1. MC-ISM光路图以及像素重分配和减帧重建结果
研究团队利用MC-ISM技术对小鼠肾切片进行了三色3D超分辨成像，在66.5μm×66.5μm×12μm的体积内，以150nm的轴向间隔实现了丝状肌动蛋白、肾单位成分及核结构的清晰分离，横向与轴向分辨率分别提升至131nm和336nm。MC-ISM有效抑制了离焦信号，展现出与转盘共聚焦显微镜相当的光学切片能力。此外，使用20倍长工作距离物镜，MC-ISM对DAPI染色的斑马鱼头部进行深层成像，同样展现出卓越的性能，在整个成像体积内细胞结构清晰可见。相较于宽场和共聚焦模态，分辨率显著提升。
图2. MC-ISM小鼠肾切片组织样本和斑马鱼成像结果
MC-ISM因其简化的探测光路而展现出增强的光子收集效率。在相同信噪比条件下，MC-ISM在1000帧成像后的荧光强度下降至67%，表明其光漂白程度低于OMX结构光照明显微镜、超分辨转盘共聚焦显微镜和Airyscan超分辨显微镜。此外，MC-ISM以7.5帧每秒的速度对U2OS细胞中的线粒体进行成像，过程中线粒体未发生肿胀现象，表现出成像系统极低的光毒性。在植物细胞中，MC-ISM成功克服了组织散射和自发荧光，实现了对拟南芥下胚轴内线粒体的原位超分辨成像，展示了其在厚植物组织中超分辨成像的独特优势。这些结果证明了MC-ISM系统在研究线粒体动态方面的优越性和广泛应用潜力。
图3. MC-ISM动物细胞线粒体和拟南芥下胚轴植物组织线粒体动态成像结果
破衍射极限现细胞真颜，执细腻笔触绘生命画卷。凭借专门的硬件设计与先进算法的完美协同，MC-ISM深入样本内部，精细观察组织深层结构，以高速度捕捉瞬息万变的生命体动态。其较低的光毒性使细胞得以自然地展现其生命力，从而揭示了生物体内复杂三维结构的奥秘。MC-ISM与现有共聚焦系统的高度兼容性，加之其成本效益和操作简便性，使其成为引领下一代共聚焦显微技术的强有力竞争者。
该成果以“Expanding super-resolution imaging versatility in organisms with multi-confocal image scanning microscopy”为题发表于National Science Review(IF：16.3)。北京大学未来技术学院博士生任伟、关美玲(现为中国科学院空天院博士后)和梁谦禧为共同第一作者。席鹏、北京大学生命科学学院李美琪为本文的共同通讯作者。论文主要贡献者还包括北京大学苏都莫日根教授，金博雅博士，博士生段光兴、张丽雅、侯宜伟，河北大学高保祥教授和研究生盖希川。本工作得到科技部重点研发计划、国家自然科学基金的支持，也得到北京艾锐精仪科技有限公司、北京大学国家蛋白质科学中心和光飞纳科技公司的帮助。
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