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仪表网 研发快讯】近日，南京理工大学电子工程与光电技术学院陈钱、左超教授课题组提出了一种新型高速、高分辨率三维无标记
显微镜技术。该工作以“High-Speed High-Resolution Transport of Intensity Diffraction Tomography with Bi-Plane Parallel Detection”为题发表在国际顶尖光学期刊Laser &Photonics Reviews，并当选为期刊封面论文。电光学院博士生周宁和张润南，硕士生徐伟胜为本文共同第一作者，南京理工大学为第一完成单位和通讯单位。
光学衍射断层扫描 (ODT) 是一种新兴的三维(3D)显微镜技术，利用透明生物样本的固有折射率 (RI) 作为自然对比机制，实现无标记成像。它能够以 3D 形式可视化和定量表征此类样本的内部结构。与传统荧光成像方法不同，ODT 无需外源荧光染料，避免了光毒性和光漂白等潜在问题。因此，这种非侵入性、无标记的方法已广泛应用于生物物理学、细胞生物学、血液学、微生物学和神经科学等各个领域，为研究人员提供了生物医学研究和临床应用的有力工具。
基于非对称照明的非干涉ODT仅需要利用样品和照明光束之间的相对角度变化在不同条件下捕获2D强度图像。随后使用这些图像重建标本的3D RI。当照明的数值孔径(NA)与物镜的NA相匹配时，低频相位分量可以完全转移到强度图像中。然而，高NA显微镜系统在实验中通常难以严格满足匹配的照明条件，导致在提高ODT的空间分辨率时出现低频缺失的问题。虽然低频区域的相位分量可以通过离焦调制转移到强度图像中，但轴向离焦需要在显微镜中引入机械运动，限制了它们在生物样本如活细胞动态成像中的适用性。因此，在无标记非干涉ODT中获得高时空分辨率的动态3D RI重建仍然是一项重大挑战。
针对上述问题，陈钱、左超研究团队提出了一种新型的高速、高分辨率非干涉ODT方法 (High-Speed High-Resolution Transport of Intensity Diffraction Tomography with Bi-Plane Parallel Detection，简称BP-TIDT)，并搭建了相关实验平台(图1)。该技术将双平面检测方案与强度传输衍射断层扫描相结合，在不引入机械位移的情况下补偿了低频下缺失的相位信息，有效地解决了传统非干涉ODT无法同时实现高时间和空间分辨率的问题。
图1 BP-TIDT实验装置和双平面并行检测光路示意图
同时，为了解决传统迭代求解方法计算时间的消耗，推导了如图2所示的双平面传输光强衍射层析理论模型，通过一次反卷积直接求解线性问题，即可得到样品的3D RI结果。为了验证所提出 BP-TIDT 方法的定量 3D RI 重建能力，使用聚苯乙烯微球作为测试样品进行了实验，并将结果与??纯相微球的模拟进行了比较。实验结果与模拟结果几乎没有差异，表明BP-TIDT技术不需要额外的轴向机械位移就可以有效实现定量RI恢复，克服了传统ODT方法在非匹配照明条件下观察到的重建质量下降和RI低估的问题。
图2 从PTF角度阐述光照条件和离焦相位调制在非干涉ODT中的重要性，并通过聚苯乙烯微球的仿真和实验结果论证BP-TIDT方法的有效性。
图3展示了BP-TIDT方法与96孔板样品室兼容性分析，以及高速高分辨率活细胞成像结果。高通量/高内涵成像在生物医学研究中至关重要，可提供详细的细胞信息和快速的图像分析。96 孔板作为高通量/高内涵成像中常用的样品室，设计有小孔径和深壁，以维持细胞生长所需的营养丰富的环境，这会限制光入射角度。图3所示的96 孔板允许的最大照明 NA 为 0.66。当照明 NA 超过此值时，孔壁会阻挡光束，导致图像信息丢失。本文提出的 BP-TIDT 方法克服了非干涉 ODT 技术中固有的匹配照明条件，使高 NA 物镜(例如 40× 0.95 NA)在高通量/高内涵成像中的应用成为可能，从而显著提升成像分辨率。
如图3(c) 所示，BP-TIDT技术结合96孔培养皿用于 COS-7 细胞的高速、高分辨率 3D RI成像。该图像显示了分裂过程中的 COS-7 细胞，具有两个细胞核。在细胞分裂期间，细胞两极的胞吞作用很明显，这是一个高能量需求的时期。这个过程对于细胞的能量和物质摄入调节至关重要。此外，作为细胞的能量来源，线粒体在低能量需求下采用细长的形状以提高代谢效率，并在细胞分裂期间变得更短更圆以满足增加的能量需求。研究结果表明，所提出的方法对药物筛选和分子生物学研究等应用特别有益。该技术通过更快的速度和更高的分辨率促进对生物样本的详细体积分析，加速了科学发现。
图3 BP-TIDT方法与96孔板样品室兼容性分析及成像结果
上述工作得到了国家重大仪器专项、国家自然科学基金、江苏省基础研究计划前沿引领专项、江苏省青年基金项目、中央高校科研专项资助项目以及江苏省光谱成像与智能感知重点实验室开放基金的支持。
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